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新型冠狀病毒:用于診斷的假病毒標(biāo)準(zhǔn)品和用于藥物研發(fā)的假病毒模型

原載自:www.bchzp.com[技術(shù)資料頻道]  2020-03-10  瀏覽次數(shù):4412

截止今天,2019-nCoV已經(jīng)在多國(guó)出現(xiàn),在中國(guó)人教科書式的疫情戰(zhàn)役之后,突然在韓國(guó)、日本、意大利、伊朗、新加坡等國(guó)家出現(xiàn)明顯的確診病例增長(zhǎng),顯然這已經(jīng)是所有人應(yīng)該重視應(yīng)對(duì)的問題了。

 

我們知道2019-nCoV具有很強(qiáng)的傳染性,隔離措施是非常必要的,針對(duì)疑似病例診斷的可靠性就是重中之重了。在前段時(shí)間,我們發(fā)現(xiàn)臨床的核酸診斷出現(xiàn)很大概率的假陰性,繼而確診時(shí)我們就結(jié)合了臨床指標(biāo),確保每個(gè)病人能及時(shí)準(zhǔn)確的得到治療。

 

那我們不禁會(huì)問:核酸檢測(cè)作為金標(biāo)準(zhǔn),為什么會(huì)出現(xiàn)這么大的假陰性概率?原因是多方面的,比如取樣部位的差異,潛伏期病毒滴度低,Q-PCR的相對(duì)定量判斷原則,試劑盒的檢測(cè)限等等。

 

科佰生物作為一家提供診斷標(biāo)準(zhǔn)品和藥物研發(fā)模型的公司,今天就這診斷和藥物研發(fā)兩方面我們做下討論。

 

我們可以分析下2019-nCoV的結(jié)構(gòu),與其他beta類冠狀病毒一致,一類具有囊膜、基因組為線性單股正鏈的RNA病毒,其中關(guān)鍵的基因有ORF1ab、Gene S、Gene E、Gene M和Gene N。

 

 

1. ORF1ab包含RdRP(RNA-dependent RNA polymerase),RNA聚合酶用于RNA的合成,常被用于診斷;

 

2. S蛋白,穿過病毒膜,并在冠狀病毒“冠狀”中形成特征性的尖峰,它被高度糖基化,可能形成同源三聚體,并介導(dǎo)受體結(jié)合和與宿主細(xì)胞膜融合,刺激中和抗體的主要抗原以及細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的重要靶標(biāo)在S蛋白上,被用于藥物研發(fā)。

 

3. 小包膜E(envelope protein)蛋白將其C末端留在包膜內(nèi),然后跨越該包膜或彎曲并在內(nèi)部投射其N末端。

 

4. M蛋白(membrane glycoprotein)具有一個(gè)短的N末端結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域在包膜的外表面上突出并跨過該包膜3次,在包膜內(nèi)留有一個(gè)長(zhǎng)的C末端,M蛋白在病毒裝配中起重要作用。

 

5. 核衣殼蛋白N(nucleocapsid phosphoprotein)與RNA基因組結(jié)合形成核衣殼。它可能參與病毒RNA合成的調(diào)控,并可能在病毒出芽過程中與M蛋白相互作用。

 

用于診斷的假病毒標(biāo)準(zhǔn)品

 

根據(jù)WHO公布,的診斷主要是圍繞N基因,另外附加其他的基因作為確認(rèn),對(duì)應(yīng)的protocol,請(qǐng)點(diǎn)擊查看。

 

 

N基因,全長(zhǎng)1260bp,以美國(guó)CDC為例,直接在N基因中選擇了3對(duì)引物、探針,而且對(duì)N1、N2、N3都做了特異性比對(duì)分析和特異性檢測(cè)分析,結(jié)論是N1和N2都是非常特異的,N3能同時(shí)檢測(cè)SARS和bat SARS。

 

 

同樣的CDC也做了檢測(cè)限分析,數(shù)據(jù)可以說是非常漂亮,展示了非常強(qiáng)的靈敏度:

 

 

但是我們發(fā)現(xiàn)整個(gè)性能評(píng)價(jià),都是使用體外轉(zhuǎn)錄的N gene RNA,然后用人A549細(xì)胞和viral transport medium (VTM)來稀釋,作為模擬病毒標(biāo)準(zhǔn)品做的。這樣我們不經(jīng)會(huì)問,是否有更合適的標(biāo)準(zhǔn)品用于性能評(píng)價(jià)?

 

按照2020年02月12號(hào)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心發(fā)布的指導(dǎo)原則《2019新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審評(píng)要點(diǎn)》中明確指出:陽性質(zhì)控品可用1~2個(gè)病毒株為代表,應(yīng)含有天然的或人工合成的包含試劑盒可檢測(cè)靶序列(如假病毒),陰性參考品則主要涉及對(duì)交叉反應(yīng)的驗(yàn)證情況,建議包括冠狀病毒(HKU1、OC43、NL63、229E)、SARS冠狀病毒(可采用假病毒)、MERS冠狀病毒(可采用假病毒)、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。

 

科佰生物應(yīng)對(duì)核酸診斷的需求,開發(fā)了一系列的假病毒標(biāo)準(zhǔn)品(假病毒也是病毒,有核酸RNA和外殼蛋白組成,但是無致病性,只需P2級(jí)),幫助企業(yè)做試劑盒的性能評(píng)價(jià),具體產(chǎn)品線為:

 

 

以2019-nCoV Gene N為例,假病毒包含全長(zhǎng)1260bp,滿足不同客戶對(duì)不同序列的需求,假病毒含有Gene N的1260bp的RNA,同時(shí)也有完整的包膜結(jié)構(gòu),需要用試劑盒提取,反轉(zhuǎn)錄,開展下游的dPCR檢測(cè)。我們采用了Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit提取,使用蘇州銳訊開發(fā)的《新型冠狀病毒(COVID-19)核酸檢測(cè)試劑盒》一步法反轉(zhuǎn)錄,然后再PCR擴(kuò)增儀(SG-200)上對(duì)病毒的拷貝數(shù)定量。

 

 

得到2019-nCov-N Pseudovirus Standard Reference的拷貝數(shù)為5.03*10e8/ml。

 

用于藥物研發(fā)假病毒模型

 

2月16日,美國(guó)德克薩斯大學(xué)*分校和美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院科研人員聯(lián)合在預(yù)印本平臺(tái)bioRxiv上發(fā)布了對(duì)2019新型冠狀病毒的研究發(fā)現(xiàn):他們確定了處于預(yù)融合構(gòu)象的2019新型冠狀病毒刺突蛋白(S蛋白)的冷凍電鏡結(jié)構(gòu),同時(shí)發(fā)現(xiàn),人體ACE2蛋白與新型冠狀病毒S蛋白結(jié)合的親和力,比與SARS病毒S蛋白結(jié)合的親和力高10到20倍。

 

S蛋白通過其受體結(jié)合區(qū)識(shí)別ACE2,因此,研究人員就以受體結(jié)合區(qū)為靶標(biāo)制備抗體,目的是阻斷受體結(jié)合區(qū)與ACE2的相互作用。美國(guó)研究團(tuán)隊(duì)還檢測(cè)了幾株SARS病毒受體結(jié)合區(qū)(receptor-binding domain,RBD)特異性單克隆抗體,發(fā)現(xiàn)它們與新型冠狀病毒S蛋白的受體結(jié)合區(qū)沒有明顯結(jié)合,這提示這兩種病毒受體結(jié)合區(qū)之間的抗體交叉反應(yīng)可能是有限的。

 

因此針對(duì)2019-nCoV的S蛋白藥物開發(fā),尤其是大分子藥物開發(fā),可能沒有什么捷徑可走,需要一步一步建立模型體系,篩選出有活性的藥物。

 

針對(duì)S蛋白和ACE2的結(jié)合阻斷,我們可以開發(fā)生化水平的檢測(cè),比如兩種蛋白的結(jié)合阻斷ELISA,那是否有細(xì)胞水平的模型?真實(shí)的模擬病毒侵染細(xì)胞的過程,進(jìn)而阻斷,來反應(yīng)藥物的效果呢?答案是有的。

 

科佰生物開發(fā)了一種表達(dá)S蛋白的假病毒,該假病毒依靠S蛋白侵染目的細(xì)胞,與目的細(xì)胞結(jié)合,進(jìn)而殺死目的細(xì)胞,檢測(cè)到信號(hào),大限度的模擬病毒的感染過程。同時(shí)該假病毒沒有致病性,只需要P2級(jí)實(shí)驗(yàn)室即可,是用于藥物研發(fā)合適的細(xì)胞水平的評(píng)估模型。

 

 

對(duì)應(yīng)的產(chǎn)品線

 

 

2019-nCoV新型冠狀病毒已然是人的公敵,看著前線醫(yī)務(wù)人員的付出,希望我們生物人,也能貢獻(xiàn)自己的力量。

 

 

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